Uma classe de endonucleases que cliva o DNA depois de reconhecer uma sequência específica, por exemplo, H1 de Bam (5´GGATCC3´), Eco RI (5´GAATTC3´) e Hin dIII (5´AAGCTT3´). Existem três tipos de enzimas endonucleases de restrição:

tipo i: cortes não especificamente uma distância maior que 1000 bp da sua sequência de reconhecimento e contém atividades de restrição e metilação.

Tipo II: Cortes em ou perto de um curto e muitas vezes Palíndromo (q.v.), sequência de reconhecimento. A enzima separada mistura a mesma sequência de reconhecimento. Podem fazer os cortes nas duas costas do DNA exatamente opostos e gerar rombas termina, ou eles podem fazer cortes escalonados para gerar extremidades pegajosas. Enzimas de restrição tipo II são aqueles comumente exploradas na tecnologia do DNA recombinante.

Tipo III: cortes bp de 24 a 26 a jusante de uma sequência de reconhecimento curtas, assimétricas. Requer ATP e contém atividades de restrição e metilação.